申基上新 | 基于一步法加帽原理，T7 共转录试剂盒重磅面世！

发布时间：2022-05-11

随着COVID-19在全球肆虐，mRNA治疗成为生物医药研发领域中的“新星”，相对于传统的疫苗，新型的mRNA疫苗具有高效、低成本、副作用小等特点，广泛应用于免疫学、肿瘤学、疫苗和先天性代谢疾病等领域的临床研究。

大多数成熟的真核生物mRNA由5’帽（m7G帽）、5’非翻译区（UTR）、编码序列或开放阅读框（ORF）、3’UTR 和poly(A) 尾组成，如图1所示。

图1、mRNA结构

mRNA的5’端帽子结构（m7GpppN）是在1970年代被发现的，它的存在赋予了mRNA稳定性并使其能够有效翻译。在细胞核中，m7G帽参与mRNA加工和核输出。在细胞质中，m7G 帽参与起始蛋白翻译和mRNA“假环化”。m7G帽本质上是mRNA上的一个独特锚点，mRNA进入细胞质，CBC（帽子结合复合物）保持与mRNA帽结合并将eIF4G（支架蛋白）和eIF4A（RNA解旋酶）募集到mRNA的5’末端，再进一步招募其他起始因子启动翻译。当与mRNA帽结合时，eIF4F复合物中的eIF4G与poly(A)结合蛋白ABP1相互作用并与mRNA的poly(A) 尾结合并形成一个似圆形mRNA的结构，mRNA的“假环化”可以确保全长mRNA被翻译并增强与核糖体的持续结合能力。

另外，m7G帽通过物理保护mRNA免受 5’→ 3’ 外切核糖核酸酶的影响，从而维持mRNA的稳定性；此外，加帽的RNA可作为先天免疫系统的标记，因为固有免疫系统对没有5’端帽子结构的RNA具有较高的敏锐度。因此，mRNA的5’端帽结构对于mRNA发挥生物学功能至关重要。

根据甲基化程度的不同，m7G可形成3种类型的帽子（图2）：Cap 0型、Cap 1型和Cap 2型。m7G通过三磷酸桥连到第一个核苷酸上，所形成的结构被称作Cap 0，在此基础上，若mRNA的第一个核苷酸的2’-羟基被甲基化，就会生成Cap 1。在功能方面来说，Cap 1的结构可以将mRNA标记为“自身RNA”，进而降低免疫原性，并且相较于Cap 1 RNAs，Cap 0 RNAs 体内活性很弱。另外，若mRNA第二个核苷酸的2’-羟基也被甲基化，则会形成Cap 2，目前Cap 2的功能尚不清楚。

图2、mRNA帽子结构

加帽方式

在mRNA体外合成过程中，目前可通过两种方式完成mRNA 5’末端的加帽：一种是使用加帽酶进行转录后加帽，另一种是使用帽结构类似物进行共转录加帽。

图3 酶法加帽过程示意图

牛痘病毒加帽酶催化的酶法加帽（图3）是较为传统的加帽方法，该方法需在T7聚合酶参与的IVT反应结束后，先纯化获得未加帽的mRNA，再通过牛痘病毒加帽酶（兼具RNA三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性）产生Cap 0，再通过2’-O-甲基转移酶和S-腺苷甲硫氨酸转化为Cap 1，再次纯化获得最终的mRNA。该过程使总体工艺步骤变得复杂、繁琐，同时增加QC质检项，在mRNA的商业化生产中，势必会使成本显著上升。

图4、帽类似物研究历程

值得关注的是，帽类似物最早在1975年就已经被文献报道了其结构。经过多年的发展，帽类似物也从前一代的ARCA发展成为目前主流的三核苷酸帽类似物（CAP GAG）。通过详细整理帽类似物相关发展历程（图4），我们可以看到早在2009年三核苷酸帽类似物（CAP GAG）就已被报道可用于T7酶IVT转录制备mRNA。化学法共转录加帽，就是在T7聚合酶参与的IVT反应体系中直接加入帽类似物，实现一步法获得含Cap 1结构的mRNA，全程只需一次纯化。这种“一锅法”反应减少了制造步骤，进而有效缩短整体处理时间、简化纯化步骤，减少所需酶的数量。因此，化学法共转录加帽在工艺上相对简单，引入杂质少，必然会成为未来mRNA领域的主流技术！

图5、两种加帽方式对比

T7共转录试剂盒

申基生物研发成功的T7 Co-transcription RNA Synthesis Kit（T7共转录试剂盒，图6）对体外转录反应体系进行了优化，本试剂盒使用T7 RNA聚合酶并以含有T7 启动子序列的线型双链DNA为模板，以NTPs和帽类似物为底物，对启动子下游的DNA序列进行转录。本试剂盒以共转录方式合成长转录本或短转录本，1 μg的模板投入量可以产生150-200 μg的RNA。