干货满满丨mRNA原液制备工艺优化策略分享！
发布时间：2022-08-22
mRNA疫苗是将编码疾病特异性抗原的mRNA通过递送系统引入体内，利用宿主细胞的蛋白质合成机制产生抗原，从而触发免疫应答。除了疫苗，mRNA技术作为通用性平台技术，理论上mRNA具有合成任意一种蛋白的潜能，有可能一定程度上替代和补充蛋白质疗法。2020年全球首个mRNA疫苗的成功上市标志mRNA技术进入商业化时代，随着前期的技术积累和疫情形势的迫切需求，mRNA技术进入快速发展时期。尽管如此，mRNA疗法的大发展还有待进一步的技术突破，比如序列优化、递送系统设计以及生产工艺的优化等方面还存在诸多挑战。
mRNA疫苗的生产主要包括：DNA模板序列的设计与制备、mRNA原液的制备及纯化、LNP包裹等步骤。其中，mRNA原液制备过程直接影响mRNA的质量和生产成本，因此优化mRNA原液的制备工艺至关重要，本文主要从加帽方法选择、IVT过程关键影响因素两个角度展开讨论。
图1 mRNA生产及装配过程
加帽方法的选择
不管是常规mRNA还是自复制mRNA，帽结构都至关重要，因此对mRNA进行加帽是mRNA制备的关键步骤。酶法加帽是较为传统的加帽方式，该方法需在T7聚合酶参与的IVT反应结束后，第一次纯化获得未加帽的mRNA，通过牛痘病毒加帽酶生成Cap0，再通过2' -O-甲基转移酶和S-腺苷甲硫氨酸转化为Cap1，经过第二次纯化获得最终的mRNA。该过程使总体工艺步骤变得复杂、引入更多的杂质，增加了QA/QC质检项。另外，加帽效率受模板长度和序列影响较大，不同模板的加帽率各不相同；而一步法共转录加帽，就是在T7聚合酶参与的IVT反应体系中直接加入帽类似物，实现一步法获得含Cap1结构的mRNA，全程只需一次纯化。这种“一锅法”反应减少了制备步骤，进而有效缩短整体处理时间、简化纯化步骤，减少所需酶的数量。因此，化学法共转录加帽在工艺上相对简单，引入杂质少，能够迅速提升mRNA疫苗和药物的产能，它也是Pfizer/BioNTech新冠疫苗所采用的加帽方法，这种方法也正在逐步成为mRNA制备的主流技术路线。相比于酶法加帽，申基生物更推荐采用一步法共转录来进行mRNA原液的制备，具体可参考“新锐国货丨申基自研Cap1帽类似物，助力mRNA疫苗加速崛起！”
表1 酶法加帽及一步法共转录加帽的优劣势对比
一步法共转录过程关键影响因素分析
2.1 起始模板
对于起始模板，我们主要需要考虑三大因素：模板序列、模板长度、模板投入量。
适用于CAP GAG参与的共转录起始模板为5'-TAATACGACTCACTATAAGG…-3' (图2)，其中高亮区域为T7启动子，在该种情况下，CAP GAG的AG两个碱基作为一个整体与模板序列进行碱基互补配对，其亲和力高于单个核苷酸，因此可以确保CAP GAG作为第一个单元开始转录，生成的mRNA加帽率在95%以上。
图2 共转录反应推荐起始模板序列、共转录生成的mRNA产量与加帽率数据
模板长度及模板投入量对于共转录产量及mRNA质量也有较大的影响。对于长度<5K的模板，随着模板长度的增加，产量也逐渐增加；而对于长度>5K的模板，长度增加会增加转录的难度，T7酶在转录过程中失活从而降低产量及mRNA完整性。另外，增加模板投入量可以显著提高共转录产量，但同时也会降低mRNA的完整性，因此对于一个全新的序列而言，需要摸索最适模板投入量，从而得到最优的产量和mRNA质量。
图3 模板长度及模板投入量对于共转录产量及mRNA质量的影响
（A）提高模板投入量显著提高产量
（B）提高模板投入量显著降低产物完整性
2.2 RNA聚合酶
T7 RNA polymerase是常用在一步法共转录反应中的RNA聚合酶，主要由32个ɑ螺旋和9个β折叠构成，分子量约99kDa。T7 RNA polymerase专门催化5'→3'方向的RNA形成过程。T7酶的活性及质量控制对于共转录产量及mRNA质量也有较大的影响，因此在mRNA原液制备工艺优化时对不同厂家的T7酶进行了筛选。我们对比了申基HiTrans® T7 RNA polymerase与市面上其他几个厂家的T7酶，发现申基的T7酶综合性能更优，结果如图4所示。
图4 不同厂家的T7 RNA polymerase对于共转录产量及mRNA质量的影响
(A)不同厂家的T7 RNA polymerase对于共转录产量的影响
(B)不同厂家的T7 RNA polymerase对于产物完整性的影响
镁离子（Mg2+）作为T7 RNA polymerase的辅因子，对于T7酶的活性至关重要。镁离子浓度过高会导致转录副产物dsRNA的大量生成；同时会导致转录时产生大量焦磷酸镁，由于焦磷酸镁溶解性差，会连带产物RNA析出从而使反应体系出现沉淀，大大降低反应产量，因此筛选合适的镁离子盐型及浓度至关重要。我们发现相比于氯化镁（MgCl2）而言，另外一种盐型（MgX）在较低镁离子浓度下对于保障IVT反应产量及产物完整性上更加有优势，结果如图5所示。
图5 反应体系中的镁离子盐型及浓度对共转录产量及产物完整性的影响
（A）MgCl2镁离子浓度对于共转录产量的影响
（B）MgX镁离子浓度对于共转录产量的影响
（C）MgCl2镁离子浓度对于产物完整性的影响
（D）MgX镁离子浓度对于产物完整性的影响
选择合适的帽类似物及NTP参与共转录反应至关重要，我们通过对比不同厂家的帽类似物及NTP发现，申基生物的EasyCap系列帽类似物及HiPure系列NTP组合综合性能更优（见图6）。
图6 不同厂家的帽类似物及NTP对于共转录及mRNA质量的影响
（A）不同厂家的帽类似物及NTP对于共转录产量的影响
（B）不同厂家的帽类似物及NTP对于产物纯度的影响
（C）不同厂家的帽类似物及NTP对于产物加帽率的影响
（D）不同厂家的帽类似物及NTP对于产物细胞水平表达效率的影响
钠离子与铵离子也是共转录反应体系中常见的阳离子，而这些阳离子浓度过高也会对T7酶的活性造成抑制。体系中钠离子与铵离子往往是由帽类似物及NTP引入的，因此选择合适的帽类似物及NTP盐型参与共转录反应至关重要，我们通过大量的实验发现，Tris盐型的帽类似物和NTP相比于其他盐型，在共转录产量、产物质量及dsRNA的控制等多个方面具有明显优势。
图7 帽类似物及NTP的盐型对共转录产量、产物完整性及副产物dsRNA生成的影响
（A）不同镁离子浓度下Tris盐型帽类似物和NTP与钠离子盐型帽类似物和NTP共转录反应2h后mRNA产量情况
（B）Tris盐型帽类似物和NTP与钠离子盐型帽类似物和NTP共转录反应不同时间后mRNA产量情况
（C）Tris盐型帽类似物和NTP与钠离子盐型帽类似物和NTP共转录反应不同时间后mRNA完整性情况
（D）Tris盐型帽类似物和NTP与钠离子盐型帽类似物和NTP共转录产物中dsRNA含量差异情况
总结
对于mRNA工艺生产来说，目前市面上各大原料厂家IVT反应体系配方相差无几，而这种通用体系往往并非最优解决方案，因此需要研究者自行对反应体系配方进行优化。可供选择的优化方向为：
1.根据模板序列及长度选择合适的模板投入量
2.筛选不同厂家的T7 RNA聚合酶，摸索合适的T7酶浓度和反应时间
3.选择合适的镁离子盐型及浓度，在共转录产量能接受的前提下获得更高的产物质量，减少副产物dsRNA的产生
4.选择合适盐型的帽类似物及NTP，提高mRNA质量，降低副产物dsRNA的产生
mRNA合成工艺的开发是一个持续的过程，申基生物将和您一起不断寻找最高效又经济的体系配比，提高共转录反应的产量及产物mRNA的质量。
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